豬胰島素(INS)酶聯(lián)免疫試劑盒

豬胰島素(INS)ELISA試劑盒

使用手冊(cè)

產(chǎn)品編號(hào)：HB055-Pg

使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本手冊(cè)。如果有任何問(wèn)題，請(qǐng)聯(lián)系我們,我們會(huì)給你提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù)。

【產(chǎn)品名稱】

中文名稱：豬胰島素(INS)酶聯(lián)免疫試劑盒

【包裝規(guī)格】

96T/盒

【預(yù)期用途】

僅供科研使用，定量檢測(cè)血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等相關(guān)樣本中豬胰島素(INS)的濃度。

【檢測(cè)原理】

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中豬胰島素(INS)水平。用純化的豬胰島素(INS)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入豬胰島素(INS)，再與HRP標(biāo)記的豬胰島素(INS)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的豬胰島素(INS)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中豬胰島素(INS)濃度。

【產(chǎn)品性能】

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無(wú)破損漏氣(如有漏氣，不影響使用）。

2、劑量反應(yīng)曲線線性

標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900。

3、檢測(cè)范圍

3 mIU/L- 80 mIU/L 。

4、靈敏度

最低檢出劑量小于0.75 mIU/L。

5、精密度

精密度用樣品測(cè)定值的變異系數(shù)CV 表示。CV（%） = SD/mean×100

批內(nèi)差：取同批次試劑盒對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，每份樣本連續(xù)測(cè)定20 次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD 值。

批間差：選取3 個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量測(cè)定，每個(gè)樣本使用同一試劑盒重復(fù)測(cè)定10 次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD 值。

批內(nèi)差： CV<5.2%

批間差： CV<8.6%

6、回收率

分別往5個(gè)不同樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白，做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍和平均回收率。

7、線性

分別往5個(gè)樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白，做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍及平均回收率。將5個(gè)樣本分別稀釋2倍，4倍，8倍，16倍做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍及平均回收率。

8、特異性

本試劑盒識(shí)別天然和重組豬胰島素(INS)，經(jīng)檢測(cè)與其它相似物質(zhì)無(wú)明顯交叉反應(yīng)。由于受到技術(shù)及樣本來(lái)源的限制，不可能完成所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應(yīng)檢測(cè)，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測(cè)的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)。

9、穩(wěn)定性

經(jīng)測(cè)定，試劑盒在有效期內(nèi)務(wù)必按推薦溫度保存，活性降低率小于5%。為減小外部因素對(duì)試劑盒破壞前后檢測(cè)值的影響，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來(lái)進(jìn)行操作可減少人為誤差。

【試劑盒組成】

注意：使用前請(qǐng)檢查試劑盒中試劑的標(biāo)簽和數(shù)量與表格是否一致。

需要但未提供的材料及耗材

  1、酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）

2、精密移液器、吸頭、加樣槽

3、蒸餾水或去離子水

4、洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6、EP管

7、無(wú)粉一次性乳膠手套

【儲(chǔ)存條件及有效期】

  1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個(gè)月。

  2、開(kāi)封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。

注意：試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實(shí)驗(yàn)需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在首次實(shí)驗(yàn)后1 個(gè)月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過(guò)期時(shí)間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。

【適用儀器】

  半自動(dòng)的酶標(biāo)儀，如Thermo MK3，或者國(guó)產(chǎn)酶標(biāo)儀。

【樣本要求】

1.樣本類型和采集

血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置0.5-2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
    血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

細(xì)胞裂解液: 吸棄培養(yǎng)液，用PBS（0.01 M，pH 7.4）將細(xì)胞洗一遍。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞（不能用胰酶和EDTA 處理），加入2-5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4）。懸浮細(xì)胞可省略。收集細(xì)胞懸液，4℃ 1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗3次。加入適量的預(yù)冷PBS或非變性細(xì)胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞,通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞量需要150-250μL PBS重懸。 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞充分裂解,也可將樣品進(jìn)行超聲破碎，以達(dá)到裂解的目的。4℃ 10000×g 離心10min，除去細(xì)胞碎片，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.樣本保存和穩(wěn)定性

樣本在2-8℃條件下，可以儲(chǔ)存72h，在- 20℃或-80℃可以儲(chǔ)存6個(gè)月及以上。樣本收集后，不是一次檢測(cè)完，請(qǐng)按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融。

【操作步驟】

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

8. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10-20分鐘。

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

注意：

1. 試劑準(zhǔn)備：試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用。準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說(shuō)明書(shū)要求保存，以備下次使用。

2. 加樣：實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的滅菌吸頭，避免污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡產(chǎn)生，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。與反應(yīng)試劑加入一樣，加樣過(guò)程中第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔加樣時(shí)間間隔盡量小（一般控制在10 分鐘以內(nèi)），如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。為了測(cè)值的準(zhǔn)確性，推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

4. 洗滌：濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。充分洗滌非常重要，在每次洗滌過(guò)程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔內(nèi)殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將吸水紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要輕輕擦除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果使用自動(dòng)洗板機(jī)，請(qǐng)?jiān)谑炀毷褂煤笤儆糜谡綄?shí)驗(yàn)過(guò)程中。

5. 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化，如觀察到顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

6. 底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

【操作程序總結(jié)】

【注意事項(xiàng)】

1. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

2. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

3. 為免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管。

4. 要嚴(yán)格避免操作過(guò)程中酶標(biāo)板干燥。干燥會(huì)使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活。  

5. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。

6. 顯色時(shí)間供參考，因用戶實(shí)驗(yàn)室條件差異，最佳顯色時(shí)間會(huì)有所不同。

7. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

8. 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

9. 揭封板膜和覆蓋封板膜時(shí)應(yīng)避免用力過(guò)大導(dǎo)致液體濺出。

【結(jié)果計(jì)算】

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

【常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法】

若實(shí)驗(yàn)效果不好，請(qǐng)及時(shí)對(duì)顯色結(jié)果拍照，保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，保留所用板條及未使用試劑，然后 聯(lián)系我公司技術(shù)支持為您解決問(wèn)題。同時(shí)您也可以參考以下資料：

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